Western Blot 又稱為蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應(yīng)的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。
其基本原理為：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標(biāo)蛋白，通過酶促反應(yīng)或者化學(xué)發(fā)光等方法將目標(biāo)蛋白可視化，從而對蛋白進(jìn)行定性或者定量研究。
「良好的開始是成功的一半」，尤其對于生物學(xué)實驗，如果沒有高質(zhì)量的實驗樣本，等待我們的很可能是失敗的實驗結(jié)果。優(yōu)質(zhì)特異的蛋白樣品對 Western Blot 實驗**關(guān)重要。下面將從蛋白樣品制備的方法和試劑選擇上給大家一些建議，同時也和大家分享一些因蛋白樣品制備不當(dāng)而導(dǎo)致 Western Blot 實驗失敗的案例。
蛋白樣品制備的基本原則
目的蛋白因其物種來源和組織特異性的不同，在種類和性質(zhì)上有很大差異，因此并沒有一種制備方法可以適用于所有蛋白的提取。這就需要我們進(jìn)行全面的分析后才能選擇**合適的蛋白制備方法，在這個過程中遵循的一個基本原則是「知己知彼」。
首先，「知己」是要了解：樣品是來自什么物種？目的蛋白定位在哪種組織或細(xì)胞器？是可溶蛋白還是不可溶蛋白？是高豐度蛋白還是低豐度蛋白？在制備時需要保持蛋白的天然活性，還是需要變性蛋白？
其次，「知彼」是要知道：哪種方法或試劑能夠防止蛋白降解、聚集、沉淀、變性、修飾？哪種能夠去除高豐度蛋白干擾，富集低豐度蛋白？哪種能去除核酸、多糖、脂肪等雜質(zhì)？哪種能在有限的實驗條件下，簡便快速地獲得高純度且完整性好的蛋白？
遵循「知己知彼」的原則對蛋白樣品制備進(jìn)行全面分析，就能明確蛋白樣品制備的合適方法或試劑。
細(xì)胞組織裂解液的選擇
裂解液是**普遍使用的蛋白提取試劑，可根據(jù)文獻(xiàn)或經(jīng)驗自行配制，也可購買商業(yè)化的產(chǎn)品。常見的細(xì)胞裂解液有 NP40、Triton X-100、RIPA buffer 等。下表是根據(jù)目的蛋白的不同定位選擇裂解液的建議。雖然裂解液的使用范圍比較廣泛，能夠滿足總蛋白的提取，但是無法做到特異蛋白的提取，特別是遇到低豐度蛋白或者活性蛋白功能分析時，通用型的裂解液存在很大的局限性。
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樣品類型 |
裂解液（Sigma-Aldrich） |
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全細(xì)胞 |
NP-40或RIPA（貨號：R0278） |
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細(xì)胞質(zhì)（可溶） |
Tris-HCl（貨號：T3253） |
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細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞骨架） |
Tris-Triton（貨號：X100） |
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細(xì)胞膜結(jié)合部分 |
NP-40（貨號：NP40）或RIPA |
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細(xì)胞核 |
RIPA或核裂解液 |
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線粒體 |
RIPA或線粒體分離試劑 |
蛋白抽提試劑盒的選擇
蛋白抽提試劑盒的出現(xiàn)彌補了細(xì)胞裂解液的應(yīng)用局限性，特別是針對難提取的樣本或者亞細(xì)胞器蛋白的提取，例如：針對植物、動物組織/細(xì)胞、細(xì)菌、酵母等不同樣品及細(xì)胞核、細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體、溶酶體等不同亞細(xì)胞器的專業(yè)提取試劑盒。這類特化試劑盒能夠針對目的蛋白的不同來源和不同組織定位進(jìn)行裂解和提取， 簡化實驗操作的同時還能提高蛋白提取的得率。
以 Sigma 公司的 CelLytic?系列蛋白提取試劑盒為例：一方面，該系列試劑盒有非變性的裂解配方，可**大程度地保留蛋白活性；另一方面，該系列產(chǎn)品無需經(jīng)過反復(fù)凍融、超聲破碎等傳統(tǒng)物理裂解方法，并能在很短時間內(nèi)得到高純度的蛋白。如：膜蛋白提取試劑盒（CE0050），通過非變性裂解配方，只需 20-30 分鐘即可得到具有天然活性的多層跨膜蛋白，且能夠有效地去除多糖、核酸等雜質(zhì)。
此外，Sigma 公司還提供一系列從生物樣品中去除高豐度蛋白，富集低豐度蛋白的解決方案。Seppro? 系列產(chǎn)品通過與多種雞來源 IgY 多克隆抗體的免疫親和吸附作用，可將樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行高度特異性的區(qū)分，從而達(dá)到富集低豐度蛋白的目的。它可以從人類的血清或血漿樣品中去除 14 種高豐度蛋白。此外，Seppro?產(chǎn)品線還能覆蓋對小鼠和大鼠樣品的處理，以及從植物樣品中去除二磷酸核酮糖羧化酶。該類解決方案能顯著降低樣品的復(fù)雜性，利于低豐度蛋白的下游檢測。
Western Blot 中的蛋白樣品危機
在 Western Blot 中如果蛋白樣品制備不當(dāng)，可能會造成無信號、弱信號、條帶大小不正確等實驗問題。下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案，供參考。
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實驗問題 |
原因分析 |
解決方案 |
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無信號、弱信號 |
樣品中不含待檢測蛋白 |
確定目的蛋白的定位，優(yōu)化蛋白提取方法 |
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樣品蛋白含量低 |
去除高豐度蛋白，富集低豐度目的蛋白（產(chǎn)品：Seppro/ProteoPrep） |
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上樣量低 |
增加電泳上樣量 |
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蛋白降解 |
添加合適的蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑 |
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條帶大小不正確 |
蛋白具有多種剪接體 |
查閱文獻(xiàn)或通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA |
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蛋白存在二聚體或者多聚體 |
增加上樣前煮沸變性時間 |
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多帶現(xiàn)象 |
細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達(dá)不同 |
使用原始未傳代的細(xì)胞株，做對照實驗 |
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蛋白具有多種修飾形式 |
是否存在糖基化、磷酸化、羥基化？ |
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去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾 |
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蛋白樣本降解 |
冰上操作，避免污染，確保加入蛋白酶抑制劑 |
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條帶扭曲、拖尾、有垂直紋理 |
蛋白樣品溶解度不好 |
優(yōu)化蛋白提取方法，尋找合適的裂解液 |
#p#分頁標(biāo)題#e#
以上是關(guān)于 Western Blot 實驗過程中如何選擇合適的蛋白制備方法和試劑的一些建議，以及由于蛋白樣品制備不當(dāng)造成實驗失敗的問題總結(jié)，希望能給大家一些幫助和啟發(fā)。此外， Western Blot 還有很多關(guān)鍵的實驗環(huán)節(jié)需要注意，比如怎樣選擇高質(zhì)量的抗體、怎樣保護蛋白樣品不被降解、怎樣配制合適的 SDS-PAGE 凝膠等，在之后的篇章里會逐步為大家介紹。
