蛋白質(zhì)印跡不是一門(mén)精確的科學(xué)，特別是在方法論意義上，直接獲得**的，出版物就緒的結(jié)果并不是常態(tài)。但是，您可以采取一些步驟來(lái)優(yōu)化Western印跡實(shí)驗(yàn)，并確保它們能夠以**佳方式開(kāi)始。這種微調(diào)過(guò)程稱(chēng)為優(yōu)化，Western印跡方案的幾個(gè)階段可以從中受益。
您的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)早在您獲得膜之前就開(kāi)始了。你可以追溯到樣品制備，但為了空間的利益，讓我們從樣品分離開(kāi)始。通過(guò)這個(gè)，你可以得到你放入的東西 - 如果沒(méi)有一個(gè)好的凝膠，你將無(wú)法得到一個(gè)好的膜，它將從那里向下螺旋。如果你自己涂上凝膠，要特別注意確保化妝的均勻性。選擇正確的丙烯酰胺百分比（參見(jiàn)Proteintech的 Western blot協(xié)議 [PDF]）。通過(guò)抵抗在高電壓下運(yùn)行凝膠的誘惑并使用等效體積的1x樣品緩沖液填充空孔，避免染色前“微笑”效應(yīng)。
**重要的是，加入均勻量的蛋白質(zhì); 通過(guò)測(cè)定確定蛋白質(zhì)濃度，并準(zhǔn)備減少您的裝載量，如果您獲得“條紋”印跡。Proteintech驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，每個(gè)泳道30μg蛋白質(zhì)通常會(huì)產(chǎn)生無(wú)條紋和良好分離的條帶。
您的膜選擇可以對(duì)Western印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。主要的兩種膜類(lèi)型是PVDF和硝酸纖維素，但現(xiàn)在消費(fèi)品市場(chǎng)上有幾種版本，包括例如針對(duì)基于熒光的免疫檢測(cè)優(yōu)化的膜或低分子量蛋白質(zhì)。
PVDF因其韌性，穩(wěn)定性和對(duì)大多數(shù)酸和堿的耐受性而受到重視（這意味著它是那些希望剝離和重新探測(cè)印跡的人的**膜）。PVDF膜還提供比硝酸纖維素更好的蛋白質(zhì)保留。
硝酸纖維素膜易于堵塞，通常可提供高信噪比。但是，你將無(wú)法剝離和重新探測(cè)它們。并注意硝酸纖維素膜的孔徑。
**后，關(guān)于實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的一句話(huà)：不要害怕因?qū)嶒?yàn)室規(guī)范而改變膜類(lèi)型。嘗試不同的東西可能是**蛋白質(zhì)印跡的關(guān)鍵。
假設(shè)您已經(jīng)付出了所需的努力來(lái) 選擇您的抗體（Proteintech也提供了指南），您的下一步應(yīng)該是確定**佳的工作抗體濃度。
抗體與抗原之間的結(jié)合速率（親和常數(shù)）受其在溶液中的相對(duì)濃度（以及其他變量，如溫度和pH）的影響。抗原豐度通常在Western印跡中固定，因此您通常需要調(diào)整抗體濃度以獲得更好的印跡。以有組織的方式進(jìn)行此操作 - 測(cè)試幾種稀釋的抗體，同時(shí)保持所有其他參數(shù)不變 - 將幫助您確定實(shí)驗(yàn)的**佳抗體濃度。
此步驟稱(chēng)為抗體滴定，應(yīng)在每次使用新抗體或一組實(shí)驗(yàn)條件時(shí)進(jìn)行。如果您注意到新批次的多克隆抗體與**后一批抗體的表現(xiàn)不同，也應(yīng)該這樣做。
如何滴定抗體
許多公司在其抗體數(shù)據(jù)表中提供了推薦的稀釋度，這些通常是很好的球場(chǎng)數(shù)據(jù)，可以幫助您入門(mén); 然而，仍然建議滴定抗體，因?yàn)橛糜讷@得推薦稀釋度的條件可能與您自己的非常不同。如果產(chǎn)品數(shù)據(jù)表建議使用1：1000的稀釋度，請(qǐng)嘗試1：250,1：500,1：1000,1：2000和1：4000的系列。
一般情況下，如果您將推薦的稀釋液加上推薦稀釋液的兩倍和一半稀釋液（另一側(cè)稀釋液稀釋液），您將處于正確的軌道上。如果沒(méi)有推薦的稀釋液開(kāi)始，請(qǐng)嘗試1μg/ ml的純化抗體作為起點(diǎn)。請(qǐng)記住保持所有其他協(xié)議參數(shù)相同，例如樣品類(lèi)型，孵育時(shí)間，洗滌時(shí)間和溫度。
關(guān)于二抗的說(shuō)明
也許你必須嘗試不同濃度的二抗 - 特別是在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的情況下。HRP標(biāo)記的第二抗體的濃度直接影響條帶的外觀(guān)。HRP酶太少會(huì)導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光信號(hào)低，光譜或光譜缺失。另一方面，過(guò)高的濃度會(huì)產(chǎn)生“燒壞”的條帶。這是由于襯底的快速耗盡導(dǎo)致中間沒(méi)有信號(hào)的帶。化學(xué)發(fā)光試劑孵育的長(zhǎng)度也會(huì)有所不同（參見(jiàn)下面的＃6，檢測(cè)）。
可以使用各種阻塞緩沖區(qū)，這些緩沖區(qū)都不適用于所有情況。為每個(gè)抗體 - 抗原對(duì)嘗試幾種阻斷緩沖液是很重要的。請(qǐng)記住，基于乳汁的阻斷緩沖液含有內(nèi)源性生物素，糖蛋白和可能干擾信號(hào)的酶。例如，含乳的緩沖液含有活性磷酸酶，會(huì)破壞您對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè); 在這些情況下，嘗試替代品，如牛血清白蛋白基阻滯劑。
在大多數(shù)情況下，每當(dāng)我有高背景信號(hào)時(shí)，修改下一次貫穿的洗滌步驟已被證明是有用的。通常，我通過(guò)將吐溫-20濃度從0.05％增加到0.1％來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。您還可以使用以下任何一種策略來(lái)改變洗滌強(qiáng)度：增加洗滌時(shí)間和體積，執(zhí)行額外的緩沖液更換或使用更強(qiáng)的洗滌劑（例如，SDS代替吐溫20）。
檢測(cè)階段對(duì)于獲得良好的Western印跡信號(hào)是不可或缺的。有許多化學(xué)發(fā)光試劑和化學(xué)發(fā)光替代品，如熒光檢測(cè) - 所以如果你目前的檢測(cè)方法不符合實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)，有很多選擇。例如，您可以選擇具有更高靈敏度的試劑或產(chǎn)生更持久信號(hào)的試劑。后一種選擇將不可估量地增加印跡的再現(xiàn)性。
在更簡(jiǎn)單的水平上，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)可以通過(guò)膠片曝光時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。這可能是**常執(zhí)行的優(yōu)化步驟，因?yàn)樗焖俣?jiǎn)單。始終將您的墨水暴露在一系列單獨(dú)的時(shí)間點(diǎn)（但請(qǐng)記住，大約10到15分鐘后，所有HRP底物將用完）。你的電影選擇也會(huì)有所作為。我總是發(fā)現(xiàn)專(zhuān)門(mén)用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的膠片 - 而不是任何標(biāo)準(zhǔn)的放射敏感膠片 - 是**佳選擇。
雖然熒光成像系統(tǒng)可能尚未供每個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用，但您所在機(jī)構(gòu)可能會(huì)提供核心或中心設(shè)施來(lái)提供此技術(shù)。基于熒光的檢測(cè)系統(tǒng)的直接優(yōu)勢(shì)是它們能夠同時(shí)檢測(cè)多種抗體，無(wú)需剝離和重新探測(cè)您的印跡。
或者，您可以完全跳過(guò)一級(jí)抗體的二次檢測(cè)，并簡(jiǎn)化您的Western印跡方案，使用HRP結(jié)合的一抗識(shí)別常見(jiàn)的上樣對(duì)照和蛋白標(biāo)簽。（以下列出的相關(guān)產(chǎn)品均以此格式提供。）
優(yōu)化的主要目的是增加特定波段的信噪比并減少非特定波段（如果存在）。不可否認(rèn)，如果您選擇優(yōu)化上述所有變量，則需要花費(fèi)大量時(shí)間; 然而，即使是一兩次改動(dòng)也可能有所不同，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看實(shí)際上可以省時(shí)間。總的來(lái)說(shuō)，我認(rèn)為優(yōu)化是一項(xiàng)非常有價(jià)值的工作 - 如果你想獲得出版品質(zhì)的西方印跡，那么這是一項(xiàng)必要的策略。
