實驗原理
SDS-PAGE電泳法，即十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳法，。
?1．在蛋白質混合樣品中各蛋白質組分的遷移率主要取決于分子大小和形狀以及所帶電荷多少。
?2．在聚丙烯酰胺凝膠系統中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），SDS是一種陰離子表面活性劑，加入到
電泳系統中能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質分子上（在一定條件下，大多數蛋白質與SDS的結合比為1.4gSDS/1g蛋白質），使各種蛋白質—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，其數量遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質間原有的電荷差別。此時，蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。
?3. 當蛋白質的分子量在15000～200000之間時，電泳遷移率與分子量的對數值呈直線關系，符合下列方程：
1gMr =K―bmR
式中：Mr為蛋白質的分子量；K為常數；b為斜率；mR為相對遷移率。在條件一定時，b和K均為常數。
若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量的對數作圖，可獲得一條標準曲線。未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。
儀器、原料和試劑
?儀器：垂直板型
電泳槽；直流穩壓電源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴鍋，染色槽；燒杯；吸量管；常頭滴管等。
?原料：低分子量標準蛋白質按照每種蛋白0.5~1mg·ml-1樣品溶解液配制。可配制成單一蛋白質標準液，也可配成混合蛋白質標準液。 ?試劑：
（1）分離膠緩沖液（Tris-HCl緩沖液 PH8.9）:取1mol/L鹽酸48mL，Tris 36.3g,用無離子水溶解后定容**100mL。
（2）濃縮膠緩沖液（Tris-HCl緩沖液 PH6.7）:取1mol/L鹽酸48mL, Tris 5.98g,用無離子水溶解后定容**100mL。
（3）30%分離膠貯液：配制方法與連續體系相同，稱丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，**后定容**100ml，過濾后置棕色試劑瓶中，4℃保存。 （4）10%濃縮膠貯液：稱Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，**后定容**100mL，過濾后置棕色試劑瓶中，4℃貯存。
（5）10%SDS溶液：SDS在低溫易析出結晶，用前微熱，使其完全溶解。 （6）1%TEMED；
(7）10%過硫酸銨（AP）：現用現配。
（8）電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3）:稱取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用無離子水溶解后定容**1L。
（9）樣品溶解液：取SDS 100mg，巰基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚藍2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸緩沖液0.5mL，加重蒸水**10mL（遇液體樣品濃度增加一倍配制）。用來溶解標準蛋白質及待測固體。
（10）染色液：0.25g考馬斯亮藍G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。 （11）脫色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水與50mL甲醇混勻。 實驗步驟
?1． 安裝夾心式垂直板
電泳槽：目前，夾心式垂直板
電泳槽有很多型號，雖然設置略有不同，但主要結構相同，且操作簡單，不易泄漏。同學們可根據具體不同型號要求進行操作。主要注意：安裝前，膠條、玻板、槽子都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。
?2．配膠：根據所測蛋白質分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。本實驗采用SDS-PAGE不連續系統，按下表的配制分離膠和濃縮膠。 ?
重蒸餾水
11.87 10.20 8.54 5.20 4.60
混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min 10%AP 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05
?3．制備凝膠板：
（1）分離膠制備：按表配制20ml 10%分離膠，混勻后用細長頭滴管將凝膠液加**長、短玻璃板間的縫隙內，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約3—4mm高，以進行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。
（2）濃縮膠的制備：按表配制10ml 3%濃縮膠，混勻后用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直**距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內，避免帶入氣泡。約30min后凝膠聚合，再放置20—30min。待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應沒過短板約0.5cm以上，即可準備加樣。
?4．樣品處理及加樣
各標準蛋白及待測蛋白都用樣品溶解液溶解，使濃度為0.5~1mg/mL，沸水浴加熱3分鐘，冷卻**室溫備用。處理好的樣品液如經長期存放，使用前應在沸水浴中加熱1分鐘，以消除亞穩態聚合。 #p#分頁標題#e#
一般加樣體積為10－15μL（即2－10μg蛋白質）。如樣品較稀，可增加加樣體積。用微量注射器小心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內都加了樣品，即可開始電泳。
?5．電泳
將直流穩壓
電泳儀開關打開，開始時將電流調**10mA。待樣品進入分離較時，將電流調**20－30 mA。當藍色染料遷移**底部時，將電流調回到零，關閉電源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片輕輕將一塊玻璃撬開移去，在膠板一端切除一角作為標記，將膠板移**大培養皿中染色。
?6．染色及脫色
將染色液倒入培養皿中，染色1h左右，用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，直到蛋白區帶清晰，即用直尺分別量取各條帶與凝膠頂端的距離。 計算
?1.相對遷移率mR =樣品遷移距離（cm）/染料遷移距離（cm）
?2.以標準蛋白質分子量的對數對相對遷移率作圖，得到標準曲線，根據待測樣品相對遷移率，從標準曲線上查出其分子量。 注意事項
?1. 不是所有的蛋白質都能用SDS-凝膠電泳法測定其分子量，已發現有些蛋白質用這種方法測出的分子量是不可靠的。包括：電荷異常或構象異常的蛋白質，帶有較大輔基的蛋白質（如某些糖蛋白）以及一些結構蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測定的結果卻是35,000。因此，**好**少用兩種方法來測定未知樣品的分子量，互相驗證。
?2．有許多蛋白質，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質，SDS-凝膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測定其分子量及分子中肽鏈的數目等，與SDS-凝膠電泳的結果互相參照。
