五種電泳技術(shù)的比較 SDSPAGE 

  名詞解釋： 

  相對遷移率（Rf）    

  問答題: 

  1.簡述SDS-PAGE的基本原理。   2.影響SDS電泳的關(guān)鍵因素有哪些？  AGE 

? 名詞解釋 1.遷移率 2.電滲 3.電泳 

? 問答題 

1.影響電泳遷移率的因素有哪些？ 

2.試述瓊脂糖凝膠電泳分離脂蛋白的原理。 CAME 

1.CAME的基本原理是什么？ 

2.CAME分離血清蛋白電泳時應(yīng)注意哪些問題？ PAGE 名詞解釋 

1.凝膠總濃度 2.交聯(lián)度 問答題 

1.與CAME相比，PAGE有哪些特點。 2.試比較CAME與PAGE操作的區(qū)別。 3.簡述不連續(xù)PAGE的原理。 

 

1.瓊脂糖凝膠電泳Agarose Gel Electrophoresis 

? Gel Electrophoresis ：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì)作支持體的電泳。 ? 特點（characteristic）： 

1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點在凝膠的孔中泳動。  2. 電泳操作方法簡便，電泳速度快。 

3. 分辨率高，重復(fù)性好，電泳圖譜清晰。 4. 適用于生化，免疫等定性定量測定。 （一）優(yōu)點（advantage) 

1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲。 

2.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。 

3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒 等大分子物質(zhì)。 4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進行染色。 

5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定。 6.有熱可逆性。 

（二）缺點(disadvantage) 

1.機械強度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。 

3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。 4.與PAGE相比，分子篩(molecular sieve)作用小，區(qū)帶少。  應(yīng)用 

1. 適用于大分子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化 2. 臨床生化檢驗中常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測 3. 為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標(biāo)   影響遷移的因素 

? the size of the molecule 

? conformation of the molecule  ? the agarose concentration of a gel ? Voltage 

百分濃度和分辨率限制 

? Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 

5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer.  

? Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide 

gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case.  

? Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High 

percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications.  

瓊脂糖凝膠分離血漿脂蛋白 

原理：      血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預(yù)染后，以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)，在pH8.6巴比妥緩沖液中電泳，根據(jù)各脂蛋白的組成、大小、形狀分離成不同區(qū)帶。 

? pH 8.6 > pI ，各種脂蛋白均帶負電，電泳時由負極到正極；VLDL為圓形，受阻力小，LDL形態(tài)不規(guī)則，受阻力大，所以VLDL跑在前。 加樣槽在負極，由負極到正極分別是CMLDLVLDLHDL 

2.醋酸纖維薄膜電泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME 特點：低吸附作用，低電滲作用，樣本用量少，親水性 1.Low sorption 2.Low electroosmosis  3.Small sample 4.Hydrophilic  電泳圖譜不齊 

①點樣時血清點加不均勻 ②薄膜局部干燥 

③電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少 ④緩沖液變質(zhì) 

⑤電泳時薄膜位置不正,與電流方向不平行  電泳圖譜分理不清 

①點樣時血清點加不均勻 

②薄膜局部干燥 

③電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少 ④緩沖液變質(zhì) ⑤電泳時薄膜位置不正,與電流方向不平行  電泳速度慢 

? 電流過低 

? 供給薄膜的液量不足 ? 緩沖液離子強度過高 

? 薄膜中雜質(zhì)  

白蛋白區(qū)帶中間部分不著色，染色不足 染色時間不夠、點樣過多 γ球蛋白向反方向移動 

電滲現(xiàn)象，可提高緩沖液液面或加大電流量以改進 區(qū)帶一邊長一邊短呈扭曲現(xiàn)象 

薄膜未緊壓在電泳槽的濾紙橋上，使薄膜接觸不良而增大了電阻。  

區(qū)帶拖尾或區(qū)帶過于緊密 

緩沖液離子強度＜0.05可出現(xiàn)區(qū)帶拖尾；離子強度＞0.075可出現(xiàn)區(qū)帶過于緊密。 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis 

[原理] CAME是以醋纖膜（CAM）作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。 

      將血清樣品點樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳時，血清蛋白質(zhì)均帶負電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點不同而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。加樣：用加樣器蘸取血清約5ul，垂直印在CAM粗糙面，點樣區(qū)距離邊緣約1.5cm，電泳時點樣面朝下。加上槽蓋平衡5分鐘后再通電。電壓10~15V/cm膜總寬。電泳40~60分鐘，泳動距離約達3.5~4cm時即可斷電。 由負極到正極可分為五條條帶 γ β α2 α1 白蛋白 #p#分頁標(biāo)題#e#

3.聚丙烯酰胺凝膠電泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE 

        PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）單體和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）交聯(lián)劑通過自由基（ free radicals）聚合而成的一種多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 

    過硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（-N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine , TEMED）為加速劑。  ¬TEMED量多少都會影響催化作用，須在堿性條件下聚合   -分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧 

  ®升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合 

PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定。可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。 

Acr/Bis：20~40   完全透明且有彈性；          ＜10    很脆，易碎，不透明；          ＞100   糊狀不成形，易破碎 常用的標(biāo)準(zhǔn)凝膠是指濃度為7.5%的凝膠 交聯(lián)度C——Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 

電極槽緩沖液通常為pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液  分離原理 1. 濃縮效應(yīng) 1）凝膠層的不連續(xù)性 

  兩層凝膠T與C不同?孔徑不同 

  濃縮膠孔徑大，分離膠孔徑小，蛋白質(zhì)在大孔徑濃縮膠中移動，受阻力小，移動速度快。  2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性 

甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3帶負電，朝正極移動，進入濃縮膠（pH6.7），甘氨酸解離度（?）很小，有效遷移率（M ?）很低，移動速度較慢，稱為慢離子。 HCl 是強電解質(zhì)，?=1，Cl-有效遷移率大，移動速度快，稱快離子。 蛋白質(zhì)（pI＜6.0）帶負電荷，有效遷移率介于兩者之間。  3）pH值的不連續(xù)性 

     為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，必須使?jié)饪s膠與分離膠之間pH值有所區(qū)別。 

3.分子篩效應(yīng)與電荷效應(yīng) 

    進入分離膠后，Gly-

成為快離子 

    分離膠只有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，根據(jù)各蛋白質(zhì)所帶電荷不同、分子大小不同而分離 

PAGE特點 

1.具有分子篩效應(yīng)，分辨率高 

2.樣品不易擴散，用量少，靈敏度可達10-6g 

3.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團 4.凝膠不帶電荷，消除了電滲現(xiàn)象 

5.機械強度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明 

6.網(wǎng)孔可調(diào)節(jié)  4.SDSPAGE 

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS,also called lauryl sulfate) 是一種陰離子去污劑(anionic detergent )。 

• 作用：破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性

(denature)而改變原有的構(gòu)象; • 保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。 原理 

（一）蛋白質(zhì)分子的解聚 

    樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小(molecular mass of polypeptides )，而電荷因素可以被忽略。 1、SDS 

   陰離子去污劑(anionic detergent )    變性劑(denaturant)    助溶性試劑  

    斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵(hydrogen bond)     分子去折疊 

    破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu) 2、強還原劑 

   巰基乙醇（β-mercaptoethanal）     

   二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(disulfide bond)斷裂。 

? SDS和還原劑的作用： 

（1）分子被解聚 

（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負   

     電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。 

（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超         過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除      了不同分子之間原有的電荷差異。 

去污劑的選擇 

無離子去污劑：Lubro W；Brij35， Tween                   Triton 

陽離子去污劑：cetyltrimethyl ammonium                bromide （CTAB）               cetylpyyridinium （CPC） 陰離子去污劑：SDS   deoxycholate 

電泳過程中的不正常現(xiàn)象 （1）“微笑”現(xiàn)象 

    指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。 2）“皺眉”現(xiàn)象 

    由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。 （3）“拖尾”現(xiàn)象 

     樣品溶解不佳引起。 （4）“紋理”現(xiàn)象 

由于樣品中的不溶顆粒引起的。 （5）偏斜現(xiàn)象 

    電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起 （6）帶太寬 #p#分頁標(biāo)題#e#

     加樣量太多或加樣孔泄漏引起 分子量測定 

1、相對遷移率（relative mobility ，Rf） 

  Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍前沿的遷移距離得到的。   測量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。