**近的一個(gè)月時(shí)間里，開始我的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵诒究频臅r(shí)候生物技術(shù)試驗(yàn)的時(shí)候都是按照試驗(yàn)書上一步步的做，等于沒有接觸過真正的實(shí)驗(yàn)，所以做western幾乎是從頭學(xué)起的。
以下是我自己這一個(gè)月的收獲，希望對大家有所啟示：
1.蛋白樣本的制備：因?yàn)槲姨崛〉氖谴笫蟮暮ｑR組織，自己覺得腦組織因?yàn)楸容^軟，所以用塑料研磨棒（而且高壓后還能重復(fù)利用）就OK，不用勻漿振蕩器就行。而相比較心肌組織比較硬，可以考慮用那個(gè)。如果說有的同學(xué)覺得上樣的時(shí)候樣本的溶解度不好，可以在上樣前在沸水中再重新煮一下（5分鐘），或者是在離心機(jī)上小轉(zhuǎn)一下。這樣蛋白溶解會好很多。
2.關(guān)于制備分離膠和濃縮膠：這點(diǎn)真是深有感觸啊，有的同學(xué)總抱怨抗體不給力，殊不知制備膠的過程在整個(gè)實(shí)驗(yàn)占著非常重要的地位，大家可以參考自己的蛋白分子量選擇分離膠和濃縮膠的濃度，以及根據(jù)膠槽的大小選擇分離膠和濃縮膠的毫升數(shù)。自己覺得還是在37度溫箱里等待膠凝固比較好，比室溫效果好。PS：一定不能心急，要各等待30分鐘。否則膠沒有完全凝固好，對電泳的影響會非常大~
3.關(guān)于蛋白上樣量，如果自己的蛋白濃度比較高，我的蛋白濃度一般都是30多微克每毫升，所以我試過20,15,10微升的上樣量，覺得10微升就足夠了。而且因?yàn)樯蠘恿可伲贵w如果比較少，結(jié)合相對來說會更好。
4.關(guān)于電泳：我的目的蛋白分子量是72KD，所以我一般是總共電泳100分鐘差不多，等待**后分離膠里面內(nèi)參完全跑開再停止電泳。之前拖尾現(xiàn)象也遇到過，自己分析是制膠的時(shí)候沒有等待膠完全凝固好所致，或者是蛋白的溶解度不好的關(guān)系。調(diào)整之后，就比較好了。另外電泳液在兩塊玻璃板之間**好用新的。
5.關(guān)于轉(zhuǎn)膜：自己摸索了5次之后，覺得75分鐘是**好的轉(zhuǎn)膜時(shí)間，膠上的條帶會充分的轉(zhuǎn)到PVDF膜上。而且不會轉(zhuǎn)過頭。另外趕氣泡的時(shí)候一定注意看膠和PVDF膜之間是不是接觸好了。
6.關(guān)于封閉：我自己試過37度脫脂牛奶搖床上搖一個(gè)小時(shí)和4度脫脂牛奶過夜兩種，覺得后者比較好。
7.關(guān)于抗體：因?yàn)橛喌氖菄a(chǎn)抗體，所以一抗都是用完之后不再重復(fù)利用，但是二抗保存在—20度還能再用一次。試過一抗4度過夜和37度搖床兩小時(shí)，可能是我的抗體在37度的溫度中發(fā)揮效應(yīng)比較好，目的蛋白都是在37度搖床兩小時(shí)這種操作方法中出的，和傳統(tǒng)的4度過夜不太一樣。我也不知道具體原因。
8.關(guān)于ECL顯色：一般我是曝光3分鐘，5分鐘和8分鐘的效果比較好。

以上就是自己的一點(diǎn)兒小心得，希望大家一起批評指正~