在電流的作用下，使蛋白質從膠轉移**固相載體（膜）上。

膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學兼容性。 有兩種規格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。

A 半干法

即將凝膠夾層組合放在吸有轉印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導電流，起到轉移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉移條件比較嚴酷，但是其轉移時間短，效率高。

1 實驗條件的選擇

電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間，具體可以根據實際適當調整。

目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度 轉移時間

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10 1.5

15--40 12 0.75

<20 15 0.5

2 實驗操作

（1）濾紙和膜的準備 (在電泳結束前20分鐘應開始準備工作)。

A. 檢查是否有足夠的transfer buffer，沒有立即配制。

B. 檢查是否有合適大小的濾紙和膜。

C. 將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉入transfer buffer中。

D. 將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。

PDVF膜在進轉移緩沖液時，要在甲醇里面泡多長時間?

PVDF是疏水性的，在轉膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤。 PVDF的預處理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后轉入蒸餾水洗兩次。用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合。

一般5-20分鐘都有人在用。可在取膠的同時泡，估計前后5分鐘左右。效果還不錯。以前有站友發貼，說處理時間沒多大關系，關鍵看膜的質量．確實是這樣的。只要讓膜完全浸透應該就沒問題了。

Hybond的PVDF說明書這樣的寫的：“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是，**少10秒鐘，多泡下也沒關系的，事實上，泡10秒的做過，10分鐘的也做過，都沒有問題的。

（2）轉移

A. 在電轉移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。

B. 將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤。

C. 將膠剝出，去掉stack gel，小心的移到膜上。

D. 剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標記出膠的位置。

E. 將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。

F. 裝好電轉移儀，根據需要選定所需的電流和時間。

G. 轉移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應及時調整。

3 注意事項及常遇到的問題：

1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。

2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。

3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外）。

4）濾紙可以重復利用，上層濾紙（靠膜）內吸附有很多轉移透過的蛋白質，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。

5）轉移時間一般為1.5 小時，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據分子量大小調整轉移時間和電流大小。

1)在疊膜、膠、紙三明治時候，操作于盛有轉膜Buffer的大平皿中進行，疊好后，再將三者平行轉移**轉膜裝置，切勿再移動，因為在buffer中操作，已經完全排除了氣泡存在的可能，無需再趕氣泡

2)關于轉膜時間：半干轉的話，20 V×30min即可

B 濕法

我們基本上不用此方法，這里暫不做介紹。

C 轉移后效果的鑒定

1．染膠

用考馬斯亮蘭染色經destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉移的效果。

2．染膜

有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于進一步的分析。