一、實驗目的

1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。

2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。

二、實驗原理

PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應就將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析**常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA復制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內(nèi)DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱**94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應做準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降**55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、實驗試劑與器材

模板DNA、2.5mmol/L dNTP

Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物

10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

PCR儀、移液槍、PCR板

四、實驗步驟

1、配制20μL反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

模板DNA    2μL

引物1      1μL

引物2      1μL

dNTP      1.5μL

MgCl2        2μL

10×buffer    2μL

ddH2O      10μL

Taq酶      0.5μL

2、設置PCR反應程序。

3、上樣，啟動反應程序。

4、擴增產(chǎn)物的電泳檢測。

附PCR技術(shù)應用

1、生命科學 a、人類基因組計劃 隨著的PCR日臻完善，科學家于2003年在完成的人類基因組“工作框架圖”的基礎上，經(jīng)過整理、分類和排列后得到的更加準確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對人類基因組基本面貌的**揭示，表明科學家們開始部分“讀”出人類生命“天書”所蘊涵的內(nèi)容。 b、后基因組計劃 人類基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態(tài)性及其單倍型以及尋找其在生物和醫(yī)學應用中重要成為人們關(guān)心的熱點。以研究基因功能為核心的“后基因組時代”已經(jīng)來臨，大規(guī)模的結(jié)構(gòu)基因組、蛋白質(zhì)組以及藥物基因組的研究計劃已經(jīng)成為新的熱點。 c、物種的分類、進化及親緣關(guān)系 可以進行物種進化的保守性分析及物種多態(tài)性分析、物種鑒定。

2、醫(yī)藥 a、疾病的診斷和治療 遺傳性疾病：如地中海貧血、鐮刀狀細胞貧血、凝血因子缺乏等有遺傳傾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚**腫瘤中的一部分，均可預測；癌基因的檢測和診斷：檢測惡性腫瘤的標記物來診斷癌癥等疾病；利用基因治療方法治療腫瘤性疾病。 b、致病病原體的檢測 檢測范圍包括細菌、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物。檢測的靈敏度和特異性都遠高于當前的免疫學方法，所需時間也已達到臨床要求，這對于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），細菌（如結(jié)核、厭氧菌）和原蟲（如梅毒螺旋體）等來說尤為適用。 c、DNA指紋、個體識別（DNA身份證）、親子關(guān)系鑒別和法醫(yī)物證 可以用一根頭發(fā)、一個細胞、一個精子來完成上述工作，這一領(lǐng)域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型。 d、生物工程制藥 許多藥物可通過工程菌和細胞來大量生產(chǎn)，如干擾素、白介素、促紅細胞生長素等藥物。 e、轉(zhuǎn)基因動物制藥及疾病模型 轉(zhuǎn)基因動物與醫(yī)學及生物醫(yī)藥研究的關(guān)系越來越密切。近年來,各種人類疾病轉(zhuǎn)基因動物模型不斷建立。如轉(zhuǎn)基因動物在遺傳病、心血管疾病、腫瘤、高血壓病、病毒性疾病、異種移植、輸血醫(yī)學、藥理學研究中的應用；利用轉(zhuǎn)基因動物-乳腺生物反應器生產(chǎn)藥物蛋白,好比在動物身上建“藥廠”,可以從動物乳汁中源源不斷地獲得具有穩(wěn)定生物活性的基因產(chǎn)品。這是一種全新的藥物生產(chǎn)模式,具有投資成本低,藥物研制周期短和經(jīng)濟效益高等優(yōu)點。

3、農(nóng)業(yè)科學 a、轉(zhuǎn)基因植物 按其功能主要分提高產(chǎn)量、抗病力、抗除草劑、改良品質(zhì)和發(fā)育調(diào)節(jié)。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。 b、轉(zhuǎn)基因動物 在農(nóng)業(yè)方面，主要在改良畜禽生產(chǎn)性狀,提高畜禽抗病力及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜產(chǎn)品。

4、考古學及歷史事件解讀利用人類短串聯(lián)重復STR-PCR技術(shù)，研究人類種族的遺傳多態(tài)性，效果非常穩(wěn)定。目前此技術(shù)已廣泛用于生物考古、種系發(fā)育、民族學、人類學和考古學等各個領(lǐng)域中。

5、衛(wèi)生安全 a、食品微生物的檢測 傳統(tǒng)的致病菌檢測首先經(jīng)過長時間的培養(yǎng)，費時費力，應用PCR技術(shù)則非常迅速、準確。主要用于：食品致病菌的檢測，如肉毒唆菌等；乳酸菌的檢測；水中細菌指標測定。 b、轉(zhuǎn)基因食品的檢測 目前世界轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)有100多物種，大多數(shù)已經(jīng)用于食品。轉(zhuǎn)基因食品對人體健康的危害及對生態(tài)的影響也日受世界廣泛的重視，因此對轉(zhuǎn)基因食品的檢測成為控制其泛濫的一種手段。 c、動、植物檢疫　靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進出口口岸的門衛(wèi)，檢查出入**的人員、動、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染病（艾滋、動物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于**之外，是提高我國綜合國力的必要保證。