[目的要求]
通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)
[實(shí)驗(yàn)原理]
瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp**50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠（ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場(chǎng)中，pH8.0條件下，凝膠中帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移。
瓊脂糖凝膠有如下特點(diǎn)：
(1) DNA的分子大小 在凝膠基質(zhì)中其遷移速率與堿基對(duì)數(shù)目的常用對(duì)數(shù)值成反比，分子越大遷移得越慢。
(2) 瓊脂糖濃度 一個(gè)特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對(duì)數(shù)與凝膠濃度(t)成線性關(guān)系。
(3) 電壓 低電壓時(shí)，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到**大，所加電壓不得超過5v/cm。
(4) 電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時(shí)的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對(duì)遷移速率在4℃與30℃之間不發(fā)生明顯改變，但濃度低于0.5%的凝膠或低熔點(diǎn)凝膠較為脆弱，**好在4℃條件下電泳。
(5) 嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的堿基對(duì)間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀遷移率降低15%。
(6) 離子強(qiáng)度 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠，電導(dǎo)率**小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化。
對(duì)于天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配制成濃縮母液，室溫保存，用時(shí)稀釋。
[實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備]
1. 恒溫培養(yǎng)箱 2. 瓊脂糖凝膠
電泳系統(tǒng)
3. 高壓滅菌鍋 4. 紫外線透射儀
[實(shí)驗(yàn)材料]
1.三羥甲基氨基甲烷（Tris） 2.硼酸
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚藍(lán)
5.蔗糖 6.瓊脂糖
7.溴化乙錠 8.DNA marker
9.DNA樣品
[實(shí)驗(yàn)步驟]
1.緩沖液的配制
配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml
Ph8.0
溴酚藍(lán) 0.25%
蔗糖 40%
③溴化乙錠溶液(EB) 0.5μg/ml
2.制備瓊脂糖凝膠
按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度 線性DNA的有效分離范圍
0.3% 5-60 kb
0.6% 1-20 kb
0.7% 0.8-10 kb
0.9% 0.5-7 kb
1.2% 0.4-6 kb
1.5% 0.2-4 kb
2.0% 0.1-3 kb
3.膠板的制備
(1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、干燥的玻璃板的邊緣（或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口）封住，形成一個(gè)膠膜（將膠膜放在工作臺(tái)的水平位置上，用水平儀校正）。
(2) 配制足夠用于灌滿
電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液（1×TBE）。準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在
電泳槽和凝膠中務(wù)必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強(qiáng)度或pH值的微小差異會(huì)在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA片段的遷移率 。
(3) 在錐瓶的瓶頸上松松地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱**瓊脂糖溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過長(zhǎng)時(shí)間，溶液將過熱并暴沸。應(yīng)核對(duì)溶液的體積在煮沸過程中是否由于蒸發(fā)而減少，必要時(shí)用緩沖液補(bǔ)充。
(4) 使溶液冷卻**60℃。加入溴化乙錠（用水配制成10mg/ml的貯存液）到終濃度為0.5ug/ml，充分混勻。
(5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固后，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時(shí)孔底將有破裂的危險(xiǎn)，破裂后會(huì)使樣品從玻璃板之間滲透。
(6)將剩余的溫?zé)岘傊侨芤旱谷肽z模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。
(7)在凝膠完全凝固后（于室溫放置30-45分鐘） ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入
電泳槽中。
低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠及濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠應(yīng)冷卻**4℃，并在冷庫中電泳。
(8)加入恰好沒過膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。
4．加樣
DNA樣品與所需加樣緩沖液混合后，用微量移液器，慢慢將混合物加**樣品槽中。此時(shí)凝膠已浸沒在緩沖液中。 一個(gè)加樣孔的**大加樣量依據(jù)DNA的數(shù)量及大小而定，一般為20-30μl樣品。
已知大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)同時(shí)加在凝膠的左凝膠的左側(cè)和右側(cè)孔內(nèi)。確定未知DNA的大小。測(cè)量未知DNA的大小時(shí)，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。
5．電泳
在低電壓條件下,線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關(guān)系,但是,在電場(chǎng)增加時(shí),不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)度的增加是有差別的。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的**大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑移到到距離膠板下沿約1-2cm處，停止電泳。
[作業(yè)]
1． 在波長(zhǎng)為254nm的
紫外燈下,觀察染色后的電泳凝膠。
2． 采用透射紫外光拍照，照相機(jī)鏡頭加近攝光圈和紅色濾光片（580-600n m）,距離50-60cm。采用全色膠卷，5.6光圈,10-20S。（或采用
凝膠成像系統(tǒng)，將圖片以文件的形式保存）
[實(shí)驗(yàn)安排]
6學(xué)時(shí)
